Анализ на публични данни

Данните за родовете на SARS-CoV-2 и датата на вземане на пробата от наличните от Чили последователности са получени от сайта на Consorcio Genomas CoV2, достъпен на https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Данните за ваксинацията са получени от публични данни от Министерството на науката, технологиите, знанията и иновациите, достъпни на адрес https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Продукт 83).

Анализ на заразността

Псевдотипирани вируси, носещи различни протеини на шипове SARS-CoV-2, бяха приготвени, както описахме по-рано¹². Накратко, псевдотипове SARS-CoV-1, базирани на HIV-2, бяха произведени в клетки HEK293T чрез трансфектиране на pNL4.3-ΔEnv-Luc заедно със съответния вектор, кодиращ pCDNA-SARS-CoV-2 Спайк в моларно съотношение 1: 1. Плазмиди, кодиращи оптимизиран от кодон шип, в който липсват последните 19 аминокиселини от С-крайния край (SΔ19), за които е известно, че избягват задържането в ендоплазмения ретикулум¹² са получени чрез генна синтеза или персонализирана насочена към сайта мутагенеза (GeneScript) и съдържат следните мутации: линия А (референтна последователност), линия В (D614G), линия В.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), линия P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) и линия C.37 (G75V, T76I, 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Всеки псевдотип препарат се изчиства чрез центрофугиране при 859 3,000 об / мин при стайна температура, количествено се определя с помощта на HIV-1 Gag p24 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems), аликвотиран в 50% фетален говежди серум (Sigma-Aldrich) и се съхранява при -80 ° C до използвайте. Различни количества псевдотипирани вируси (определени от нивата на HIV-1 р24 протеин) бяха използвани за заразяване на HEK-ACE2 клетки и 48 часа по-късно, луциферазната активност на светулка беше измерена с помощта на реагент за анализ на луцифераза (Promega) в микропланшет Glomax 96 луминометър (Promega).

Анализ за неутрализация

Анализите за неутрализиране на псевдотипиран вирус бяха извършени по същество, както описахме по -рано¹². Накратко, серийни разреждания на плазмените проби (1: 4 до 1: 8748) се приготвят в DMEM с 10% фетален говежди серум и се инкубират с 5 ng р24 от всеки псевдотипиран вирус в продължение на 1 час при 37 ° С и след това, 1 × 10⁴ на HEK-ACE2 клетки бяха добавени към всяка ямка. HEK293T клетки (не експресиращи ACE2), инкубирани с псевдотипиран вирус (линия А), бяха използвани като отрицателна контрола. Клетките се лизират 48 часа по -късно и се измерва луциферазната активност на светулка, като се използва реагент за анализ на луцифераза (Promega) в луминометър Glomax 96 Microplate (Promega). Процентът неутрализация за всяко разреждане се изчислява и ID50 на всяка проба се изчислява с помощта на GraphPad Prism версия 9.0.1.

статистически анализи

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуера GraphPad Prism версия 9.1.2. Бяха извършени множество групови сравнения за неутрализиращи титри на антитела (NAbTs) срещу панел от вируси на псевдотипирани SARS-CoV-2, както и сравнения на отговорите на NAbs по пол и статус на дим, като се използва сдвоен тест с класиране на Wilcoxon. Промяната на фактора се изчислява като разликата на средния геометричен титър в ID₅₀ в сравнение с вируса на псевдотипиран вирус тип Wild. Анализът на корелацията между NAbTs и възрастта или ИТМ беше извършен с помощта на теста на Спиърман. За статистически анализ на заразността бяха проведени еднопосочни ANOVA и тестът на Tukey за множество сравнения. Стойност p ≤ 0.05 се счита за статистически значима.

Етично одобрение

Протоколът на изследването е одобрен от Комитета по етика на Медицинския факултет на Университет Чили (проекти № 0361-2021 и № 096-2020) и Клиника Санта Мария (проект № 132604-21). Всички дарители подписаха информираното съгласие и техните проби бяха анонимизирани.

Влияние на пиковите мутации в ламбда варианта върху инфекциозността и неутрализиращите отговори на антителата

Анализ на 3695 последователности от Чили, депозирани в GISAID към 24 юни^th 2021 г. показва ясно доминиране на вариантите на SARS-CoV-2 Гама и Ламбда по време на последното тримесечно отчитане, заедно, за 79% от всички последователности.

Интересното е, че този период се характеризира с масирана кампания за ваксинация, в която 65.6% от целевата популация (18 -годишни и по -възрастни индивиди) са получили пълна схема за ваксинация към 27 юни^th 2021

Като се има предвид, че 78.2% от хората, инокулирани с пълна схема, са получили инактивираната вирусна ваксина CoronaVac от Sinovac Biotech, ние се опитахме да проучим влиянието на шиповите мутации, присъстващи във варианта Lambda, върху неутрализиращия капацитет на антителата, предизвикани от тази ваксина.

За това генерирахме псевдотипирани вируси на базата на HIV-1 SARS-CoV-2, носещи протеина на шипа от референтната линия Wuhan-1 (див тип; линия A), мутацията D614G (линия B) и алфата (линия B .1.1.7), варианти на гама (линия P.1) и ламбда (линия C.37).

По време на подготовката на вируса, ние последователно наблюдаваме, че клетките, инфектирани с псевдотипиран вирус, носещ ламбда шип, произвеждат значително по -високи стойности на биолуминесценция в сравнение с D614G мутанта или алфа и гама варианти, показващи повишена инфекциозност, предизвикана от протеина на ламбда шипа

Фигура 1.Инфекциозност, медиирана от различни протеини с шипове.

(А) Схематично представяне на протеина с шипове SARS-CoV-2 и вариантите, използвани в това изследване. Линиите са посочени в скоби. RBD, рецептор-свързващ домен, CM; цитоплазмена опашка.

(Б) Титруване на псевдотиповете на всяка линия, използвайки еквивалентни количества HIV-1 p24. Луциферазната активност на светулка се измерва като относителни луминесцентни единици (RLU) на 48 часа след заразяването. Средната стойност и SD бяха изчислени от представителен трикратен експеримент.

След това използвахме споменатите по -горе псевдотипирани вируси, за да извършим анализи за неутрализация, използвайки 79 плазмени проби от здрави здравни работници от Университет Чили и Клиника Санта Мария в Сантяго, Чили.

Изключихме 4 проби, тъй като не успяхме да изчислим ID50 титър. От анализираните проби 73% съответстват на жени, средна възраст 34 години (IQR 29 - 43) и индекс на телесния макс (BMI) 25 (IQR 22.7 - 27). 20.5% от участниците са декларирали, че са активни пушачи по време на имунизационния период. Пробите бяха взети за средно 95 дни (IQR 76 - 96) след втората доза от ваксината CoronaVac

Наблюдавахме, че неутрализирането на псевдотипирания вирус, носещ протеин от див тип, води до 50% инхибиращо разреждане (ID₅₀) среден титър от 191.46 (154.9 - 227.95, 95% CI,), докато той е 153.92 (115.68 - 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% CI) ) и 78.75 (49.8 - 107.6, 95% CI) за псевдотипирани вируси, носещи спайков протеин от D614G мутант или алфа, гама и ламбда варианти, съответно.

Ние също така забелязахме, че средният геометричен титър на ID₅₀ титрите са намалели с фактор 3.05 (2.57 - 3.61, 95% CI) за псевдотипирания вирус, носещ ламбда шипа, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% CI) за гама шипа, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% CI) за шипа Alpha и 1.37 (1.20 - 1.55, 95% CI) за шипа D614G в сравнение с шипа Wild.

Не се наблюдава връзка между пола, възрастта, индекса на телесна маса (ИТМ) или състоянието на дим и неутрализиращите титри на антителата в нашата кохорта.

Фигура 2.Неутрализационен анализ с помощта на плазмени проби от CoronaVac ваксини

(А) Промени в реципрочния 50% титър на неутрализация (ID₅₀) в плазмени проби от 75 получатели на ваксината CoronaVac срещу D614G (линия В), Алфа (линия В.1.1.7),

Варианти на гама (линия Р.1) и Ламбда (линия С.37) в сравнение с вирус от див тип. Резултатите са показани като разликата в неутрализиращите титри на съответстващи проби. P стойности за сравняване на ID₅₀ се изчисляват с тест на Wilcoxon с подписан ранг.

(В) Графичните полета показват средния и междуквартилния диапазон (IQR) на ID₅₀ за всеки псевдотипиран вирус. Факторните промени се показват като разликата на средния геометричен титър в ID₅₀ в сравнение с тези за псевдотипиран вирус тип Wild. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на критерия за ранг на Wilcoxon за съвпадение на двойки.

Заедно нашите данни разкриха, че протеинът на шипа на новопризнатия вариант на интерес Lambda, силно циркулиращ в Чили и южноамериканските страни, носи мутации, причиняващи повишена инфекциозност и способност да избягат от неутрализиращи антитела, предизвикани от CoronaVac.